第四章 园艺植物种质资源的保存

第一节 低温种子库保存

第二节 植物体保存技术

第三节 植物种质资源保存的其它方法

第四节 种质信息管理与核心种质的建立

植物种质资源是人类极其珍贵的财富。人们通过各种途经获得的种质资源搜集品，必须以适当的方式妥善保存，以达到遗传资源持续利用的目的。所谓植物种质资源保存（conservation of plant germplasm resources），是指通过人为的技术措施保护植物种质资源，使其不至于流失或灭绝。目前，保存植物种质资源的方法主要分为原生境保存（in situ conservation）和非原生境保存（ex situ conservation）两大类。其中原生境保存包括自然保护区（nature reserves）和自然公园（natural park）；非原生境保存包括三个类型：一是活体植株保存，如植物园（botanic garden）、田间种质圃（field genebank）；二是种子库（seed storage facility）；三是离体保存库（in vitro storage）。

第一节 低温种子库保存

低温种子库是栽培植物种质资源保存的主要方式，全世界拥有的作物种质资源96%以上是以种子形式保存的。1954年，美国建成世界上第一座低温种子库国家种子贮藏实验室（NSSL），至20世纪90年代中期已有40多个国家建立了长期低温库。美国和印度各拥有一座容量100万份的长期低温库。保存种质量较大的低温库有CGIAR中心库、中国国家作物基因库、美国NSSL、俄罗斯瓦维洛夫植物研究所基因库，此外，还有日本、德国、印度、韩国等国的国家基因库。

我国20世纪80年代在中国农科院作物品种资源所建成两个国家低温种质库。1号库容量24万份，现作为交换使用，1999年扩建完后，容量可达48万份；2号库是国家长期库，拥有两间库房，总面积307 m2，容量为40万份，温库-18℃±2℃，RH50%±7%。1994年在青海西宁建成一座国家复份库，低温库房面积76.5 m2，总容量40万份。近20年来，我国还在各省（市、自治区）农科院和中国农科院各专业所建成了20余座中期库。台湾省植物遗传中心建于1993年，其中长期库和中期库容量分别为24万份和25万份。

一、种子贮藏寿命及其影响因素

所谓种子寿命，是指种子生命力在一定的环境下能保持的最长期限。事实上，在一个种批中由于母体植株所处的环境条件、植株的营养状况、种子着生部位、以及种子在发育期间所处环境不同，种子个体间生命期限存在着很大的差异。同时，种子成熟后所处的环境条件也对寿命影响极大。因此，种子寿命应该以种子群体的平均寿命来表示。一个种子群体中，单个籽粒寿命的变化符合正态分布。因此，一批种子的寿命，是指在一定环境条件下，一个种批的发芽率从种子收获后至降到50%所经历的时间，这段时间又称半活期。作为种质资源的种子，一般要求发芽率达到80%以上。当一个种批的发芽率降至50％时，这批种子实际上已失去保存价值。于是，种子寿命的定义可修订为：一批种子的群体生活力，在一定贮藏条件下，能保持或接近在母体植株上达到生理成熟时的发芽率（80%），并且能萌发长成正常植株的期限。从这个意义上说，种子寿命涉及到的，不仅是种子在实验室理想条件下的发芽率，还包括田间不适宜环境条件下的萌发能力。一批种子在广泛的田间环境条件下，能迅速整齐地萌发并长成健壮幼苗的内部潜在能力的总和，也就是种子活力。

自然界有些种类的种子寿命长达上千年。如1952年中国科学院北京植物园的研究人员把在辽宁普兰店孢子村干塘池墉的泥岩中挖掘出来的古莲子经过处理后播种。古莲子不仅发芽了，还于1955年开花。经14C同位素鉴定，这些种子的寿命为1 040±210年。有些种子寿命极其短暂，如在开放条件下，杨树种子只存活30 ~ 40 h，柳树种子仅1周左右，可可种子仅35 h。有一种沙漠植物种子离开母体植株后只能存活几小时，是世界上种子寿命最短的植物之一。短命种子一般都属于本章第三节将要介绍的顽拗型种子。大多数种子的寿命处于上述两者之间。Ewart曾对1 400个种及变种的种子进行研究，根据种子在自然条件下的相对寿命长短把它们归为三类：一是长命种子，寿命在15 ~ 100年或更长，如番茄、茄子、西瓜等种子。二是中命种子，寿命在3 ~ 15年之间，如萝卜、白菜、黄瓜、甘蓝、莴苣、辣椒、菜豆、菠菜等种子。三是短命种子，寿命在3年以下，如葱、胡萝卜、芹菜等种子。

影响种子寿命的贮藏条件主要是水分和温度。其中水分因素包括种子含水量（MC）和种子贮藏环境的空气相对湿度（RH）。MC越高，呼吸作用越强，贮藏物质的分解越快，生活力丧失也越快。MC与RH密切相关。当RH增加时，MC随之上升。到一定程度便出现游离水，这时的种子含水量为“临界含水量”。当出现游离水时，种子内水解酶、呼吸酶等酶的活性异常旺盛。这种情况下，种子很容易丧失生活力。根据哈林顿（harrington, 1960）提出的原则，种子含水量在5% ~ 14%的范围内每降低1%，其寿命便延长一倍。但种子对含水量降低有一个忍耐范围，而且不同种类的种子，这个范围值存在着差异（种子适宜含水量见本章第三节）。

温度是影响新陈代谢的主要因素之一。在低温状态下，种子细胞内代谢活动水平很低，物质和能量消耗少，细胞的衰老进程也很缓慢，因而可以长时期保持种子生活力。在高温状态下，情况则相反。因此，降低种子贮藏环境的温库便可延长种子寿命。这是低温种子库保存种子的主要依据。哈林顿认为在0 ~ 50℃范围内，温度每下降5℃，种子寿命即可延长一倍。

水分和温度这两个关键因素相辅相成。低温保存种子必须结合较低的含水量和空气相对湿度。因为高温状态下，即使在安全含水量的种子也会衰老得较快；而高含水量的种子在低温条件下可能会遭到伤害。种子对低温的适应性，主要取决于细胞液浓度。种子含水量低、则细胞液浓度高，在冷冻条件下受伤害的可能性小。低温种质库延长种子寿命，是在维持种子低含水量的前提下实现的。哈林顿认为，种子安全贮藏的指标应是空气相对湿度（％）+ 温度（℃）的和不超过100。

二、种子低温贮藏设施

我国于1984年建成国家中期库。1986年在洛克菲勒集团资助下建成国家种质长期库（2号库），两间库房总面积307 m2，库温 -18±2 ℃，RH 50%±7%，可容纳40万份种质；另有4间用于新品种保护的库房，总面积72 m2，温度 -8 ~ -18℃。1994年在青海西宁建成国家种质复份库，面积76.5 m2，库温-10℃，可容纳40万份种质。1999年，在国家中期库原址兴建“国家农作物种质保存中心”，2002年底投入使用，总建筑面积3500 m2，由种质保存区、前处理加工区和研究试验区三部分组成。保存区共分成12间冷库，其中5间长期贮藏冷库，6间中期贮藏冷库和1间临时存放冷库。国家种质库保存总容量达到近百万份。国家长期库入库种质已达333 505份，隶属35科、192属、712种，其中蔬菜30 156份（115种）、西瓜992份、甜瓜962份。长期保存的种质数量处于世界第一。中国农科院专业所已有7座特定作物中期库。全国各省（市、自治区）农科院已建成15座中期库。台湾省植物遗传中心建于1993年，其中长期库和中期库容量分别为24万份和25万份。

1．低温种子库的主要类型

低温种质库按其功能分为三类：（1）长期库。用于长期保存基础种质搜集品。温度范围在-20 ~ -10℃，相对湿度不大于60%。国际上对正常型种子长期保存推荐的参考标准为 -18℃或更低的温度条件，种子含水量5±1%（以湿重为基础）。封入不透气的容器内，如密封的金属盒、铝箔袋、塑料复合薄膜袋、玻璃瓶等。种子预期寿命30 ~ 50年，或者更长。（2）中期库。用于保存流动种质搜集品。温度范围0 ~ 10℃，相对湿度不大于60％。种子容器与长期库的相同。种子含水量6% ~ 9%。种子预期寿命10 ~ 30年。（3）短期库。用于保存工作搜集品。温度范围15 ~ 20℃，相对湿度50% ~ 60%。种子容器从有孔到几乎密封，如纸袋、塑料袋、布袋、玻璃瓶等。种子含水量12%以下。种子预期寿命2 ~ 5年。

2．低温种子库的基本结构

（1）低温库房　是低温种子库的主要组成部分。容量依用途和入库种子量而定，高2.4 ~ 4.0 m。库内置放种子架，架上可分层放密封的种子盒或种子袋，里面装入各种检验合格、并已干燥到预定含水量的种子。库内种子架分固定式和活动式两种。种子架与地面、墙壁、屋顶之间的最小通风空隙分别是10 ~ 20 cm、20 cm和50 cm。通风空隙不能太小，以免产生局部温差。

（2）围护结构　包括保温层、隔汽层、护墙板和库门。保温层常用硬质聚氨酯、聚苯乙烯两种泡沫塑料和碳化软木。隔汽层一般用两层石油沥青油毡，中间再加一层铝箔，三层石油沥青热粘合而成。护墙板材料一般用喷漆电镀不锈钢较好。库门四周要有加热封条，以防止门被冻结。

（3）致冷系统　是低温种质库的心脏，包括致冷设备、除霜设备、恒温控制器和高温报警器。它使库房内温度维持在设定范围内，上下温差为±1 ℃。每个冷库要安装两套独立的致冷系统，每台最大的设计负荷为每天工作16 h，以月为期轮换使用。

（4）辅助设施　包括低温库房门外的缓冲间、种子接收分发间、种子清选间、熏蒸间、数据处理间、发芽间、种子干燥间、种子包装间、种子临时贮存库等。

种质库的选址应考虑气候、交通、电力、给排水、地震及环境污染等情况。0℃以下低温库的地基在建筑施工前要进行防冻处理，以免冷气透过保温屋侵入地基形成冻土层，土壤冻结后发生膨胀，严重时使低温库底部不均匀抬起，破坏库体结构。基于同样的道理，建库用的各种建筑材料都有一定的质量要求，以免在周期性的冻融过程中遭破坏。

三、种子入库程序

作为种质资源保存的种子，从接纳到入库定位，期间要经历一系列的过程。这些过程必须按部就班，有条不紊地进行。下面以我国国家作物种质资源库为例，说明种子入库的基本程序（图4-1）。

种子入库前的生活力检测。这一环节，一方面是确定所接纳种子的生活力是否达到入库标准，另一方面也是为种子繁殖更新提供参考。作为种质资源保存的种子入库前发芽率要求在90％以上。发芽率试验所取种子量为400粒或200粒，分四次重复。不同种的种子对发芽条件要求各异，在做发芽试验时要区别对待。种子发芽试验温度和所需时间可参考《国际种子检验手册》。四次重复中如有一个超出误差范围，应去掉它。计算其它三个的平均数。如果有两个超过误差范围，需重做发芽试验。倘若重做结果仍有两个超过误差范围，则将两次试验八个重复的结果相加，取其平均值，作为该样本的发芽率。

图4-1  种子入库程序。

国家种质库对各种作物采用三级分类编号方法。首先将栽培植物划分为4大类：Ⅰ代表农作物；Ⅱ代表蔬菜；Ⅲ代表绿肥、牧草；Ⅳ代表园林、花卉。每一大类分为若干小的类型，用单个阿拉伯数字表示。具体作物编号用大写英文字母表示。品种用5位阿拉伯数字表示，如Ⅱ2A02531代表大白菜的某个品种，Ⅱ9E00146代表叶用莴苣的某个品种。在编库号的过程中还需逐份核对种子性状，核对的项目包括粒色、粒形、大小、饱满度、整齐度、有无表面附属物、有无特殊气味等。

拟入库种子应把含水量降到5% ~ 7%之间，少数种类（如豆类）含水量需在7％以上。种子量少时可用干燥剂干燥，种子量大时用种子干燥箱。含水量测定方法参照《中华人民共和国国家标准——农作物种子检验规程》。多油的种子采用稳定低温烘箱法，烘箱温度为101 ~ 105℃，加热15 ~ 17 h；其它种子采用稳定高温烘箱法，烘箱温度为130 ~ 133℃，加热时间为1h。豆类和西瓜种子需要粉碎。当种子含水量超过30%（需粉碎的种子超过17%）时需进行预干燥。种子烘干后，在干燥器中冷却30 ~ 45 min，再称重。含水量计算公式为：

MC（%）=

要求两次重复误差在0.2%以内。

种子包装尽可能在3 h内完成。入库种子样品量最好采用种子计数法，但许多种质库喜欢用称重法。我国国家库种子入库数量要求是：小粒种子（千粒重<5 g）50 g；中粒种子（千粒重20 ~ 100 g）6 000粒；大粒种子（千粒重100 ~ 400 g）2 500粒；个别特大粒种子（千粒重 > 1 000 g）1000粒。考虑种子贮藏期间的检测损耗，每份材料可增加15％的入库数。种子装入种质库专用容器内，加上标鉴，立即密封。标鉴上注明材料名称、种子量、入库时间。种子存放位置可采用如下方法编号：A010201，A是冷库编号；01为架子排号，02为架子层号，01为种子筐或种子屉编号。把存放位置编号记入档案。

四、种子生活力监测与繁殖更新

种质库为种子提供了适宜的环境，但种子毕竟是活的生命体，在贮藏过程中会逐渐衰老死亡。生活力下降的速度在物种间和品种间差异很大，如国家库在库存种质保存10 ~12年后，对23种作物的1.8万份种质进行监测，发现95%的种质发芽率保持在85%以上，5%的种质发芽率有不同程度的下降，特别是胡萝卜、莴苣等短寿命种子。入库种子几乎全部干燥到同一含水量标准，也是引起部分种子生活力下降的原因，如辣椒种子适宜贮藏含水量是10%，干燥到5% ~ 7%含水量后，贮藏寿命明显降低。此外，繁殖地和种子起始发芽率也影响库存种子的生活力。因此，低温库贮藏种子生活力监测已成为种质安全保存的核心。

1．种子生活力监测

（1）发芽试验　种质库种子发芽力监测有固定样本量法和序列测定法。固定样本量法如前所述，由于消耗种子量大，不宜用于种质库种子监测。序列测定法可在不影响监测准确性的前提下，把一次试验的种子数减少到20粒。

（2）生活力测定　种子生活力测定方法很多，可以分为破坏性测定方法和无破坏性监测两类。（A）破坏性测定方法有四唑（TTC）染色法、靛红染色法、二硝基苯染色法和红墨水染色法。四唑染色法是国际通用的种子生活力快速测定法。生化速测的结果用两份试样的平均数表示，保留整数。（B）无破坏性监测是在既不破坏种子结构也不影响种子原有生活力的前提下，采用某些物理方法间接测定种子生活力的方法。如软х射线造影法、荧光分析法（包括紫外线荧光法、纸上荧光圈法、荧光染剂法）、渗出物检测法（包括电导率法、光密度法、尿糖试纸法）、自由基测定法，等等。

2．种子繁殖更新

对于大多数植物物种，当种子生活力降到85%以下时，就要进行繁殖，或者当某一样本中种子数低于完成繁殖该物种三次所需的种子量时，也需要繁殖。如果对某一物种种子质量有疑问时，则应首先考虑繁殖，以免失去该样本。原则上，一次不要处理太多的材料。样本少、做得好，比样本多、做得差所达到的效果好些。一般来说，低温种质库保存的种子在2年内生活力不会有很大的下降。因此，繁殖更新可以分年度逐批进行。

繁殖时从低温库中取出装待繁殖种子的容器，当温度升到室温后再打开，取出种子，装入编号标记的种子袋内用。取样量不超过现有该材料种子的半数。取样最好在除湿的房间操作，记录种子量。将余下的一半种子放回库中，待新繁殖的种子经检验合格后，入库替换库存的种子。繁殖过程必须严格按计划进行，防止混杂。繁殖的种子成熟后，在同一材料不同植株上采集相同重量的种子进行混合，从而使母本效应降至最低限度，同时在样本内部尽可能多地保持变异。

繁殖更新必须选择适合所繁材料生长发育的环境，特别注意某些植物对日照的要求，否则可能不会开花结实，无法收获种子，给繁殖更新工作带来严重损失。当待繁殖的种子处于休眠状态时，必须对种子进行处理，打破休眠再播种。

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第二节 植物体保存技术

一、种质圃与植物园

1．植物园

植物园的发展历史可追溯到古代中国和地中海沿岸国家。我国汉代的汉武帝于公元前138年重修秦朝的上林苑，栽种从远方进贡的名果木、奇花异卉达2 000余种。这已具备植物园的雏形。北宋司马光的独乐园中采药圃则恰似一座小型植物园。有120畦种植“草药”挂有药牌名。有“蔓药”攀缘竹子形成步廊，四周还有“木药”。建于1543年的意大利比萨大学植物园被公认是西方最早的植物园。现代植物园的历史大约只有200年，但其发展却很快。目前，全世界设有植物园1 600多所，其中约60%分布在欧洲。我国现代植物园从本世纪初开始发展。庐山植物园、南京中山植物园、台北植物园都是早期植物园。60年代全国还只有30座植物园。如今已达到140余座，而且还在发展之中。

植物园按其性质可分为综合性植物园和专业性植物园。通常综合性植物园具有物种保护和基础研究、经济植物开发利用、提供休闲游览服务、科普教育、技术推广性生产活动5大功能。这一类型归科学院系统管理的以科研为主，如北京植物园（南园）、南京中山植物园、庐山植物园、华南植物园、武汉植物园、西双版纳植物园；归园林系统管理的以观光游览为主的，如北京植物园（北园）、上海植物园、杭州植物园、厦门植物园、深圳仙湖植物园等。专业性植物园又称为附属植物园，指根据一定的学科、专业内容布置的植物标本园、树木园、药圃等。如浙江大学植物园、北京药用植物园、南京药用植物园、华南热带经济植物园、浙江林学院植物园、武汉大学树木园。

全世界现有700座植物园具有保存植物种质资源的作用。一部分内部专门设有种质圃，如北京植物园（南园）中设有野生果树种质圃。许多植物园都设有园林植物种质资源保存区域，如北京植物园（南园）的宿根花卉园、牡丹园、芍药园、月季园、水生、藤本植物和藤本植物区、药用植物园。在我国专业性植物园中，北京药用植物园和南京药用植物园，海南热带经济植物园与园艺植物种质资源保存关系密切。目前，我国植物园（树木园）保存的各类高等植物有23万种，除去重复和国外引种的，属于中国野生植物区系成分的约有16 ~ 18 万种，占区系成分的55% ~ 65%，其中首批公布的濒危种类约300种，占公布数字354种的80%以上。我国自20世纪80年代初着手建设地区性珍稀濒危植物的迁地保护基地和繁育中心，对珍稀濒危野生植物以及林木、果树、观赏植物、药用植物、农作物和茶、桑等经济植物进行保护性繁育。已建成繁育中心15个。中国科学院于2002年底启动一项规模庞大的植物园建设计划，目标是将中国本土75%的植物种类引种到植物园里并有效保护起来，以保护本土植物资源为主。

2．种质圃

种质圃严格地说不是植物园。它们附属于某类栽培植物的科研单位，主要用于栽培植物种质资源保存，以及分类和引种的研究。其功能高度专一，一般不提供休闲游览服务。无性繁殖的和多年生栽培植物的种质材料以及一些作物的野生种和野生近缘植物主要在种质圃中保存。全世界拥有的植物种质资源8.7%是以种质圃的形式保存的。美国、欧洲、日本等许多国家一些国际农业研究中心及亚洲蔬菜研究和培育中心都很重视种质圃的建设。我国种质圃的建设从20世纪80年代开始。20年代80年代初，农业部投资建立和完善了15个果树种质圃（表4-1）。“七五”期间，通过国家科技攻关，又新建种质圃9个，用于保存野生稻、甘薯、水生蔬菜、花生、茶、桑、苎麻、

表4-1　国家作物种质资源圃（园艺植物）

牧草等的种质材料。“八五”期间通过国家科技攻关项目补建了开元甘蔗圃，并正式批准沈阳农业大学山楂资源圃为国家种质圃。另外还有4个种质圃已基本建成，分别用于保存野生棉、多年生小麦野生近缘植物、葡萄、橡胶热带作物种质资源。它们尚未列入国家计划，但已是国家作物种质资源的重要组成部分。

我国通过“七五”和“八五”科技攻关，已将原分散在全国的大部分资源材料进行了主要农艺性状的鉴定和编目，入国家种质圃保存。到1995年底，国家种质圃已入圃保存的作物种质资源为50多种（类），共约4万份材料。分属于1026个种（含亚种）。其中16个国家果树种质圃保存果树种质资源11 536份。武汉国家水生蔬菜种质圃保存水生蔬菜种质资源1 339份（表4-2）。台湾植物遗传资源中心拥有7个位于不同海拔高度的田间基因库，用于保存无性繁殖材料。截至1996年9月该中心各类保存设施共贮藏了287 694份材料。

表4-2　中国植物种质资源库（大陆各省）