第七章 园艺植物种质资源的改造

第一节 芽变的利用

第二节 单胞无性系筛选

第三节 花粉和花药培养

第四节 原生质体融合

第五节 植物基因工程改造

通过园艺植物种质资源的调查、搜集、鉴定和整理以后，大多数的种质资源都是可以直接用作园艺植物育种的亲本材料，许多可以应用于栽培生产。但是，在一些情况下，手中掌握的现有种质资源不能满足上述要求，这就需要我们对这些种质资源进行改造。种质资源改造的目的主要是为了向育种提供实用的亲本材料，不是直接向生产上提供品种，因而，侧重于对现有栽培品种易在农业环境中丧失的抗逆性、抗病性等性状的改造，和对野生资源通常不具备的农艺性状如产量、商品性等性状的改造。因而，其改造的途径、方法虽然与育种学中讲述的内容大体上相近，但是由于各自目的不一样，又各有所侧重。在本章中，主要讲述芽变的利用、单胞无性系筛选、花粉和花药培养、原生质体融合和基因工程改造等。

第一节 芽变的利用

我们知道，生物的遗传保证了物种在一定环境条件下，亲代的性状相对稳定地传给子代，使之不断传递给后代；变异则使生物有可能适应变化的环境而进一步发展（进化）。但是，不是所有的变异对生物生存繁衍都是有利的，尤其是突变，在大多数情况下是有害的，不利于生存的。不过，也有很少量的突变对生物或对人类是有利的。因而，我们可以通过对这些变异的筛选，在原有种质资源中选择出希望出现的性状。

由于体细胞突变发生在芽的分生组织中，当芽萌发生长后可能表现出与相邻枝条原有类型不同的性状，这一类变异称之为芽变。对于无性繁殖的作物产生的芽变，可用分株、扦插等手段加以分离、保存和繁殖。随着植物组织培养技术的发展，分生组织培养和茎尖培养等作为无性系繁殖的手段，使得芽变的利用不仅仅局限于无性繁殖的作物，使利用芽变改造园艺植物种质资源得到了进一步拓展。它们不仅用于获得有益突变体，而且可用于加速突变系的繁殖和脱毒等。

一、分株和扦插分离

园艺植物有许多是无性繁殖的，蔬菜作物如马铃薯、菊芋、山药、大蒜、石刁柏等是无性繁殖的，但是，尤其以果树和花卉植物较普遍。这些无性繁殖作物不用通过有性繁殖阶段，不会产生分离现象，在其生长过程中发生的芽变，只要得以分离繁殖，就可以保持稳定。通过有性繁殖的作物发生的芽变，也可以将其加以利用，只是要经过有性分离阶段，才能使其稳定，供作进一步利用。因此，一般说来，只要可用分株、扦插的植物，都可以将其在生长过程中发生的芽变，通过分株的方式和扦插的方式将它们分离出来，从而获得稳定的突变系，繁殖为无性变异系，供直接或间接利用。但是，芽变在许多情况下都表现出嵌合体结构，常常会出现不稳定性。

二、分生组织培养法

这一方法是将变异植株的枝条顶端切下，用自来水反复冲洗干净后，再用75%酒精漂洗，然后，转入2%次氯酸钠中浸泡15 ~ 30 min，取出用蒸馏水冲洗3次，置无菌滤纸上吸干，在超净工作台上，用灭过菌的解剖刀和解剖针，将生长点剥出，切成几微米至几毫米的小块，接种到有琼脂培养基（如MS培养基）的玻璃瓶中，封口后放在培养室培养。培养室光照强度通常保持1 500 ~ 5 000 Lx，温度为25 ~ 27℃。当形成愈伤组织后，应及时转到新的培养基上，进行继代培养。当分化成小植株并长到一定大小时，将其取出，洗掉根上的培养基，移栽到以珍珠岩等为基质的载植盘中，经受自然条件锻炼一定时间后，再定植于露地。由于分生组织在培养过程中还会产生变异，需要进行单株分离，稳定后，才能视作新的种质资源。

三、茎尖培养

茎尖培养所用的外植体为几毫米的完整的茎尖，而不是象分生组织培养那样用的是几微米的分生组织，但是，其培养过程与分生组织培养是相似的。通常在MS培养基中去除萘乙酸（NAA），不经过愈伤组织阶段而直接形成小株丛。当小株丛长到一定密度时，将其分株转移，以加速繁殖。当繁殖到所需株数时，再分单株移栽到以珍珠岩等为基质的载植盘中，使其根系进一步发育，稍加锻炼即可定植到露地。这一方法因不经过分生组织培养阶段，较能保持原有变异，因而只要将其繁殖，加以鉴定，即可供作新的种质资源。

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第二节 单胞无性系筛选

由于生物体突变频率低，在自然界发现适合于我们人类需要的性状突变是很难的，即使是出现了也常常是嵌合体而难以利用，因此，尽管分生组织和茎尖培养方法发展了芽变的利用，但是其作用还是不能满足种质资源改造的要求。而单细胞培养，不仅提高了突变率，也可利用细胞的全能性分离培养获得突变体（mutant）。突变可以是自发产生（自发突变），也可以受诱变剂诱发产生（诱发突变），但是它们本质上没有差别。影响突变频率的因素包括植物的遗传基因型、年龄、细胞和组织继代培养的时间、培养部位、培养基的组成和培养的环境条件等。单胞培养 可以使大量细胞在小规模的实验室内得到选择或鉴定，而且由于细胞培养不受环境季节变化的影响，筛选可以周年进行。

单细胞培养是基于植物细胞的全能性而发展起来的。因为植物的单细胞在特殊的条件下培养，可以通过细胞分裂形成细胞团，再进一步分化成根、茎、叶、芽或胚状体，最后获得完整植株。利用单细胞培养可以在人工控制条件下有方向地增加无性变异频率，创造人们所需的无性变异株，获得单胞无性系，这是人工创造变异的重要途径之一。单胞无性系的获得，通常是用分散性好的愈伤组织或悬浮培养物来制备单胞，也有用纤维素酶和果胶酶直接分离园艺植物不同组织制备单胞的；获得单细胞后，用适宜的培养方法，可培养获得单胞无性变异系或无性繁殖系。其在园艺作物上的应用主要集中在抗病、抗盐、抗除草剂和对温度抗耐性等突变体的筛选。

一、单胞的获得

单胞的获得有许多方法，主要有酶分割法和愈伤组织分散法等。

1．酶分割法

这是将园艺植物具有分生能力的根尖、茎尖、下胚轴、子叶等用酶解分离获得游离单细胞的方法。具体操作是将所取材料用清水洗净，在0.1% ~ 1%的升汞或2%的次氯酸钠中浸泡5 ~ 10 min，然后用蒸馏水冲洗2 ~ 3次，无菌滤纸吸干，在无菌环境下，用解剖刀将其分成几毫米的小块，置于装有纤维素酶和果胶酶的悬浮培养液的三角瓶中，经过一段时间培养之后，用搅拌、振荡等方法使之离散，直到在显微镜下观察到大量游离细胞后，用不同规格的细胞筛进行无菌过滤，去除未分解的器官残留物、组织和细胞团，培养液中剩下的单个游离细胞和较小的细胞团即可作为单胞培养的接种液。

2．愈伤组织分散法

这是用愈伤组织分离获得游离单细胞的方法。它是将园艺植物的器官或组织采用一般的组织培养方法诱导愈伤组织，把产生的愈伤组织继代培养，然后将继代培养的愈伤组织置于悬浮培养液中。可加少量纤维素酶和果胶酶以促使愈伤组织离散，还可用搅拌、振荡等方法加速其离散。最后，将这种悬浮液用一定规格的细胞筛去除未分散的愈伤组织和较大的细胞团，这样剩下的游离细胞和较小细胞团的悬浮液即可作为接种液。

二、单胞系的培养

为了有目的的改造园艺植物种质资源，在经上述过程获得游离细胞或小细胞团后，可根据改造目的，有意改变培养基的成分和/或培养条件，使单细胞在人工设定的条件下发生变异（可能是随机突变的变异，也可能是生物有方向的适应变异），经条件选择实现对单胞系的筛选。例如，为了改造获得耐高温种质，可提高培养温度和光照强度；为了获得抗寒种质，可降低培养温度；为了选育抗盐种质，可增加培养基中无机盐的含量等。单胞系培养的方法有平板培养、看护培养和悬浮培养等。

1．平板培养

该方法通常是用吸管取单胞悬浮液（一般应保持在0.5 ~ 1 × 104个细胞 / mL的密度）2 mL作接种液，接种到含有0.6%琼脂无菌液态培养基（35℃）中，并使培养基与接种液充分混合，倒入直径9 cm的无菌培养皿里，在无菌环境下降温固化后，用塑料薄膜封严培养皿。经双筒显微镜（40倍）检查细胞分散情况，并用标记笔标出若干单胞位置。然后置于25℃左右的黑暗或弱光下培养。在培养过程中发现单胞已分裂为细胞群时，应及时在无菌条件下，转植到固体培养基的三角瓶中，进行继代培养。到出现球形胚时，再转入新瓶继代培养。待植株长到一定大小时，洗根并转入灭菌土中栽培。

在平板培养过程中，应当注意以下几点：（1）不同园艺作物、不同组织的单胞对同一培养基的反应不同，应当根据所取材料对选用的基本培养基中的某些成分进行调整实验，以提高培养效果；（2）选用分裂盛期的细胞接种效果好；（3）培养的起始密度很重要，接种的细胞数少常常导致平板上单细胞形成细胞团的百分率，即植板率低；（4）接种过程中会带有少量细胞团和组织块，有时它们还能提高单胞的植板率。

2．看护培养

用愈伤组织来看护单细胞使之生长和增殖的方法称为看护培养。它是在无菌条件下，将几块直径几毫米的愈伤组织放置在固体培养基上，再在其上放一张无菌滤纸，经过12 h左右后，用毛细玻璃管吸取接种液（单胞）滴接到滤纸上，用塑料薄膜封严瓶口，置于25℃左右的黑暗或弱光下培养。培养一个月左右可形成细胞团，2 ~ 3个月可形成球形胚。此时，应及时将其转移到新的培养基上，进行胚培养，当形成小植株后，移出洗根并转入灭菌土中栽培。

3．悬浮培养

这是将游离细胞在液体培养液中进行培养的方法。接种好的三角瓶应当放置在摇床上（25℃，黑暗或弱光）培养。在培养过程中，可定期或不定期将其置于倒置显微镜上，检查细胞分裂情况。当培养液中出现较大的球形胚时，在无菌条件下，将其挑接到固体培养基上进行继代培养，随后同上操作。悬浮培养往往难于确定球形胚是单胞分裂分化形成，还是由细胞团分裂分化形成。但是，它们都能发生不同程度的变异，因而都可以作为人工创造变异的途径。

不管是平板培养，还是悬浮培养，在混有愈伤组织和较大细胞团的情况下，单胞分裂快；在悬浮培养汇中，单胞密度大的比密度小的单胞分裂速度快；在用无菌滤纸过滤用过的悬浮培养液（条件培养液）中，即使接种的细胞密度低于最低临界密度，它们也能生长和分裂。一般认为，出现上述现象是因为虽然每个细胞都能合成它生长和分裂所需要的全部代谢产物，但是，在单胞培养过程中，由于每个细胞形成的代谢产物不断向胞外渗漏，使得胞内存留的代谢产物有时低于细胞分裂临界浓度。而许多细胞在一起培养时，提高了培养基（液）中这类代谢产物的浓度，使之保持在实现细胞正常分裂的临界限度以上，从而促进细胞分裂。

三、突变体的选择

通过单胞培养会产生大量突变体，其中绝大多数是有害的，但是也能产生极少量有益的突变体。通过选择有可能获得一些有益的无性突变系。通常是在单细胞的继代培养中，根据种质资源改造的目标，有目的地改变培养基（液）的成分或培养条件，对产生的单胞系植株进行筛选。例如，为了选育抗盐性强的种质资源，可增加培养基（液）中的无机盐的含量；为了筛选耐高温的种质资源，可提高培养室的气温和光照强度；反之，为了筛选抗寒的种质资源，可降低培养室的气温等。这些培养基（液）的成分或培养条件的控制原则，是使单胞系的培育过程中有一半左右发育不好或死亡，只有一般左右的能正常生长发育。对单胞系的筛选，除了在室内进行人工控制条件的鉴定选择外，还应在植株开花时，逐株进行染色体倍数鉴定，确定是否二倍体，分株套袋隔离进行人工控制自交。获得的单胞系还要经过对改造性状和其他经济性状经过田间鉴定，才能获得实现改造目的的种质资源。

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第三节 花粉和花药培养

植物花药内含有大量花粉，花粉所含染色体数是其体细胞的一半。当我们将花药或花粉在适当条件下培养时，可以人为地改变花粉发育的途径，使花药内或单离的花粉由配子体转向孢子体发育，其花粉经过多次分裂或分化，最后形成为原有亲本材料孢子体一半染色体数的单倍体植物。花粉和花药培养事实上是一种特殊的单胞培养。所谓单倍体植物是指具有配子体染色体数（n）的植物。它包括两种情况，一是培养二倍体植物的花药或花粉获得的单倍体植株只含一个染色体组，二是培养多倍体植物的花药或花粉获得的“单倍体”植株含多个染色体组。花药或花粉培养获得单倍体植株，可通过染色体加倍得到纯合的二倍体，加速获得纯系，提高选择效果；还可为基因分析、基因互作和外源基因导入等方面的研究提供理想材料。

单倍体植物普遍存在于自然界中，但是其自然发生率极低（通常为0.002% ~ 0.02%），实际上难以利用。因此，人工诱导产生单倍体植株引起了人们的关注。花药或花粉培养开始于20世纪40年代，最初研究的目的是如何调节和控制从花粉母细胞的成熟花粉的生长发育。Grogory（1940）以曼佗罗（Datura stramonium）、番茄（Lycopersicon esculentum）和麝香百合（Lilium longiflorum）等为材料，培养含有减数分裂前花粉的花药，使花粉母细胞发育成为四分孢子。60年代后Guha和Maheshwari用毛叶曼佗罗（Datura innoxia）花药培养获得单倍体植株后，在园艺植物上通过花药和花粉培养，获得了许多单倍体植株，有些已应用于生产。

一、花药和花粉培养的方法

1．花药培养

花药培养诱导形成单倍体植株有胚状体（embryoid）和愈伤组织两条途径。胚状体途径是培养花药中的花粉首先分裂形成原胚多细胞团，然后在药室内侧经过球形胚、心形胚、鱼雷形胚等发育阶段，最后以胚状体的形式出现。茄子、甜椒等茄科作物，大白菜、油菜等十字花科作物均可通过该途径获得单倍体。愈伤组织途径是培养花药中的花粉经过多次分裂形成单倍性愈伤组织，再将其转移到分化培养基上分化出根和芽，从而获得单倍体植株。番茄等作物经此途径可获得单倍体植株。

2．花粉培养

花粉培养是通过一定方法将花粉从花药里取出，直接培养花粉获得再生的单倍体植株的过程。由于花粉培养完全排除了花药组织的干扰，使得既可以避免花粉与花药组织在培养过程中分裂和增殖的竞争，有利花粉植株的形成，还可省略花药培养获得再生植株是否来自花药的鉴定程序。

用于花粉分离和培养的方法有两种，即机械分离培养法（液体或固体培养基培养）和散落花粉（shed pollen）培养法。

（1）机械分离培养法　通常是选取单核中期花粉的幼花蕾消毒，用无菌水清洗干净后，取出花药置于培养液中，再用机械方法（如用注射器的内筒）轻轻挤压花药，使之散出花粉粒。然后，用40 µm网筛过滤，得到的花粉悬浮液在500 ~ 800 rpm下离心3 min，弃上清，再用相同培养液重复离心3次，将花粉密度调整至1 ×104 ~ 5 ×104个/mL，悬浮培养约25 d后可见到胚状体，随后转到固体培养基上培养，步骤与花药培养相同。机械分离花粉时，难免会造成花粉的损伤，于是有人采用散落花粉培养法。

（2）散落花粉培养法　这种方法是利用花药在液体培养基中漂浮培养时，因花药开裂而将花粉自然释放到培养基中，然后将花药取走，散落出的花粉留在原培养基或更换新的培养基进行培养。有一些作物利用该方法效果较好，但是要注意找到合适的预处理措施，使花药在漂浮培养时能迅速开裂而释放出花粉。

二、影响花药和花粉培养的因素

提高花药或花粉培养获得单倍体植株的诱导率，是获得足够数量以供选择的单倍体植株的前提。影响花药和花粉培养的因素很多，主要有以下几个方面：

1．供体植株的基因型

供体植株的基因型不同，在花药或花粉培养过程中，诱导其形成花粉植株的难易程度有较大差异。

2．供体植株的生理状态和栽培条件

通常从生长旺盛的植株上取早期现蕾的花药或花粉进行培养，较易形成花粉植株；取蕾前，供体植株的栽培条件的好坏也影响花粉植株的诱导率。

3．花粉发育时期

大多数植物通常以单核中期至单核晚期的花粉容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。花粉发育时期可以用醋酸 - 洋红将花粉染色后，显微镜观察确定；也可以结合显微镜观察，用花瓣、花药和萼片的长度，以及相互之间的比例来确定。

4．培养前和培养初期的预处理

有报道称低温（如4℃）预处理一定时间（如48 h）可以明显促进胚状体的形成，有的经短期高温（30 ~ 40℃）处理也能够促进胚状体的形成，但是不同作物对所需的最适处理温度和时间要求不同。

5．培养基

不同的作物种类或品种的花药和花粉培养所要求的培养基成分不同，因此要选用合适的培养基。常用的基本培养基主要有MS、Nitsch、Millor和B5等，可以从有关专著或论文中找出一般适用的培养基配方。除培养基的种类外，在培养基的其他添加成分中，植物激素（种类和浓度等）对花药和花粉培养的影响较大。蔗糖是很好的碳源和调节渗透压的物质，但不同作物种类对蔗糖的浓度要求不同。此外，氨基酸、维生素、活性炭和硝酸银等对花药和花粉培养的效果也有一定的影响。

6．培养条件

培养温度通常保持在25℃左右，光照因作物种类不同而异。在花粉培养的早期，黑暗或弱光条件可能更有利于花粉分裂的启动。

三、再生植株倍性的鉴定和加倍

在通过花药培养获得的再生植株中，除单倍体植株外，还有非单倍体（包括二倍体、多倍体和非整倍体等）植株。花药培养获得的单倍体通常来自花粉，而非单倍体则来源复杂。在通过花粉培养获得的再生植株中，虽然倍性也有变化，但是由于在操作排除了体细胞的干扰，所以获得的再生植株基本上来自花粉。不管怎样，对获得的再生植株都要进行染色体鉴定，以确定其倍性和利用价值。

获得的单倍体再生植株如果不经过染色体加倍成为二倍体，是不能结籽的，必须要有筛选和染色体加倍的过程，使之成为纯合的二倍体可育植株。实现染色体加倍有自然加倍、人工诱导加倍和愈伤组织再生二倍体植株三个途径。

1．自然加倍

在诱导单倍体植株的过程中，会有很少的植株发生自然加倍。这种加倍频率很低，不过它比人工诱导加倍较少表现畸变。要注意区分由于花药壁、花丝等亲本二倍体愈伤组织分化的植株与真正由花粉分化而自然加倍的植株。

2．人工处理诱导加倍

常用方法是利用秋水仙碱处理。处理的适宜浓度和时间，随植物种类和处理部位的不同而有差异。常用的浓度范围为0.1% ~ 1%，处理时间为24 ~ 48 h。一般来说，秋水仙碱浓度的越高，处理的时间要求就越短，反之，浓度越低，处理时间则要求越长。处理材料及部位包括培养细胞、试管小苗、顶芽、腋芽或花轴等。处理结束后，要求用清水洗净。

3．从愈伤组织再生二倍体植株

由于在愈伤组织培养过程中，会出现较高频率的核内有丝分裂，从而导致染色体数目的加倍。因此，可以利用单倍体花粉植株的茎段或其他部分培养，使之产生愈伤组织，然后在分化培养基上进一步分化芽和根，形成并通过细胞学检查筛选获得二倍体植株。 

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第四节 原生质体融合

原生质体融合又称为细胞杂交，它是建立在原生质体培养技术基础之上的。植物原生质体由于已去除了细胞壁，它能够像动物细胞一样，在人为的条件下互相融合，获得细胞杂种植株。如果用近缘种内或种间的原生质体融合,可以获得稳定的,具有双亲两套染色体的细胞杂种植株，它们往往可育，可以直接作为育种的种质材料；如果用远缘不亲和物种间的原生质体融合，可以获得常规有性杂交得不到的无性杂种植株，不仅克服了远缘杂交不亲和性，而且可以扩大植物的变异范围，拓宽种质来源，选育出新种质，甚至产生新种。

植物原生质体融合按照所用亲本原生质体的性质可以分为三类。第一类最为常用的即体细胞杂交，它是用双亲的体细胞原生质体或其衍生系统进行诱导融合，再经培养、筛选、鉴定、等步骤得到细胞杂种；第二类是配子间细胞杂交，它是用双亲的性细胞原生质体为融合亲本，其他步骤同第一类；第三类是配子－体细胞杂交，其一个融合亲本为性细胞原生质体，另一个为体细胞原生质体，其他步骤同也第一类。目前工作以体细胞杂交为主。自Carlson等在1972年获得第一株烟草体细胞杂种植株以来，细胞融合技术的完善和发展，使获得的融合杂种植株越来越多。例如马铃薯（2x）+ S. brevidens(2x)、马铃薯（4x）+ S. brevidens（2x）、马铃薯（4x）+ S. phureja（2x）、马铃薯 + 番茄、马铃薯 + 龙葵、马铃薯 + 醋栗番茄、马铃薯 + 烟草、拟南芥菜 + 白菜型油菜、甘蓝 + 大白菜、白菜型油菜 + 花椰菜、脐橙 + 温州蜜桔、脐橙 + 葡萄柚、甜橙 + 枳、哈姆林甜橙 + 两列蠔壳刺、哈姆林甜橙 + 飞龙枳等。由于植物细胞具有坚固的细胞壁，要进行体细胞杂交，首先要获得无细胞壁的原生质体；而且杂交以后要进行原生质体培养，获得完整植株才有希望成功。因此，进行体细胞杂交的过程中，有一些问题必须注意。

一、原生质体的来源

植物的各个器官，如根、茎、叶、子叶、下胚轴、果实、种子及其愈伤组织和悬浮细胞等，都可作为分离原生质体的材料。但是，不同物种、同一物种不同基因型、同一基因型不同取材部位等，对于原生质体的融合和培养都有影响。要注意扩大和选择合适的基因型，例如，花椰菜原生质体培养表现出早熟品种优于中熟和晚熟品种，晚熟品种最差。最终还要打破基因型的限制，使之具有普遍实用意义。同一基因型的植株生长在不同的环境条件中，由于它们的生理状态会有所改变，在离体条件下对各种培养基或培养条件的反应也会有所不同，因此，取用在控制条件下培养的一定部位的外植体来置备原生质体可以提高重复性。茄科植物一般选择生长旺盛、生理状态一致的刚展开的幼嫩叶片，十字花科植物一般用种子萌发4 ~ 5 d的无菌苗下胚轴，豆科植物用未成熟种子胚的子叶，禾本科植物则以幼胚、幼穗、花药（花粉）或成熟胚建立胚性愈伤组织及其胚性悬浮细胞系为好。

二、原生质体的获得

植物细胞脱去细胞壁即可获得原生质体。1960年英国植物生理学家Cocking首次用纤维素酶降解番茄幼苗根尖细胞得到原生质体，从而开创了用酶解法分离植物原生质体的新时期。从理论上说，只要用适当的酶处理，就能从任何植物的任何活的组织或其培养的细胞系都可以分离得到原生质体。但是，要得到产量高、活性强、能进行分裂、杂交后能形成愈伤组织或胚状体，最后再生成完整植株的原生质体，则受许多因素影响。就影响原生质体分离时的数量和质量来说，除了上述提到的取材以外，还要考虑到酶的种类及其组合、酶液的渗透压、原生质膜的稳定剂、酶解时间与温度、分离和纯化的方法等。

用于植物原生质体游离的酶组成主要是纤维素酶和果胶酶，有时再加入半纤维素酶。酶液浓度一般为纤维素酶1% ~ 2%，果胶酶0.5% ~ 1%。浓度过低，去壁率低，影响原生质体分裂；浓度高则破裂多，产率低，褐化严重，分裂频率低。酶液pH 5.1 ~ 5.8，酶解时间几小时至几十小时不等，以获得足以满足所需原生质体的数量为准。但是，酶解时间过长会造成先前已经游离的原生质体解体、破碎或非目的融合，所以，一般不超过24 h。酶解温度以45 ~ 50℃最佳，但对植物细胞来说太高，一般都在25℃左右酶解。这有利于保持原生质体的活力。酶解处理通常静置在黑暗中进行，偶尔用手轻轻摇晃即可。对于愈伤组织、悬浮细胞等难游离原生质体的材料，可置于低速（30 ~ 50 rpm）的摇床上促进酶解。

植物细胞除去细胞壁后，如果酶液中的渗透压和细胞内的渗透压不平衡，原生质体有可能涨破或收缩。因此，在酶液、洗液和培养液中，应当加入渗透压的稳定剂，使得其渗透压大致与原生质体内的相同或相近。广泛使用的调节剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖或麦芽糖，其浓度在0.4 ~ 0.6 mol·L-1，都具有相同的稳定渗透压的作用。加入CaCl2、KH2PO4、MES、葡聚糖硫酸钾等都可以提高原生质膜的稳定性。

植物材料经酶解后，需要将原生质体与组织残渣，以及酶液分开，使原生质体纯化，才能进行融合和培养。因植物种类和采用的渗透压稳定剂不同，纯化的方法也有所不同。最常用的方法是过滤和离心的相结合的方法。通常用40 ~ 100 µm尼龙网或镍丝网过滤，收集滤液并离心（500 ~ 800 rpm）3 ~ 5 min，取上清。转到洗液（除不含酶液外，其他成分与酶液相同）中，再次离心，取上清，如此重复3次，即可获得纯净的原生质体。

三、原生质体的融合

常规的原生质体融合是用双亲的原生质体经诱导、筛选和鉴定，然后得到杂种细胞。由于原生质体具有各自亲本的全部遗传信息，即双亲的细胞核、细胞质和细胞器都集中到一个融合细胞中。这与有性杂交细胞内的情况不一样，原生质体融合除了涉及双亲的细胞核外，还涉及了双亲的细胞质。它不仅可以把细胞质基因转移到全新的核背景中，也可以使叶绿体基因组与线粒体基因组重新组合。这既给遗传育种提供了新的种质资源，有带来了较为复杂的关系。如果杂交组合是近缘而亲和的，则通过细胞杂交可以得到具有双亲所有遗传信息的细胞杂种，它们是对称的细胞杂种。但是当双亲的亲缘关系较远时，有不少原生质体融合得到了杂种愈伤组织后，由于不同程度的遗传不亲和性而不能得到再生植株或可育的再生植株，此外，杂种细胞在离体培养或继代选育中，常常发生某一亲本的染色体部分丢失以至全部丢失。因此，虽然细胞杂交技术可以克服部分远缘组合间的不亲和性，但是尚未能从根本上解决此问题。

后来发展了一种不对称细胞杂交技术，可以比较容易控制亲本的遗传物质，在远缘基因组间转移性状。它是将供体的部分遗传物质转入受体。其机理是控制融合产物中的染色体丢失和基因重组，将一个亲本有限的基因转入另一个亲本，从而得到不对称杂种。如果所得到的细胞杂种完全没有供体的核基因，而仅仅转入供体的叶绿体和线粒体基因，则称之为胞质杂种。采用的方法是用物理或化学因子（如X射线、γ射线、IOA-碘乙酰胺、R6G等）处理供体原生质体，影响它们的代谢功能或使之仅仅带有少量的染色体，再与未经处理的受体原生质体进行诱导融合后得到细胞杂种。

原生质体融合的常用方法有化学方法和电融合方法两类。化学方法中以聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）应用广泛。它的融合频率高达10% ~ 15%，且无种属特异性，几乎可诱导任何原生质体间的融合。用PEG进行融合时，PEG的种类、纯度、浓度、处理时间，以及原生质体的生理状况与密度等是影响融合效率的重要因素。加入融合促进剂（例如伴刀豆球蛋白、15%二甲基亚砜、链霉素蛋白酶等）可以提高原生质体的融合率。电融合技术发展快、应用最多。它有两个步骤：第一，在装有原生质体悬浮液的两电极间加高频交流电场（一般为0.4 ~ 1.5 MHz，100 ~ 250 V·cm-1），使原生质体偶极化而沿电场线方向泳动，并相互吸引形成与电场线平行的原生质体链；第二，用一次或多次瞬间高压直流电脉冲（一般为3 ×10 µs，1 ~ 3 kV·cm-1）引发质膜的可逆性破裂而形成融合体。Schweiger（1987）将电融合法与微培养法结合起来，建立了单对原生质体融合技术。其方法是将两个异源原生质体转移到微滴融合液中，用直径为50 µm的白金电极在倒置显微镜下进行融合操作，待融合后，将融合的异核体移到微滴培养液中培养，再生成杂种植株。

四、原生质融合体的培养

两个亲本的原生质体互相融合后形成异核体，异核体在再生细胞壁进而有丝分裂的过程中发生核融合，即得到杂种细胞。原生质体融合后即可进行培养。培养的方法有液体培养、固体培养和二者的改进培养方法。有用液体浅层培养，以改善透气性，便于观察和培养基的添加的；也有用琼脂糖软包埋法，以防止原生质体聚集和增加透气性的，还有的用双层培养、微滴培养和看护培养等等。使用的培养基有KM8P、改良的DPD、MS、NTH和Du等。

五、杂种细胞的筛选

如何将杂种细胞与未融合的、同源融合的区分开，是原生质体融合过程中的重要一环。杂种细胞的筛选方法主要有三类：第一类是利用或诱发各种缺陷型（如叶绿素缺失、营养缺失）或抗性（对某种药物有抗性）细胞系，用选择培养基将互补的杂种细胞选出来；第二类是利用或人为地造成两个亲本间原生质体的物理特性（如大小、颜色、漂浮密度等）差异，从而选出杂种细胞；第三类是利用或人为地造成细胞生长或分化能力（如内源激素、再生能力、生化抑制剂等）的差异，从而进行选择。在实际应用过程中，这三类方法往往视具体实验对象而互相配合使用。

六、体细胞杂种植株的鉴定

虽然杂种细胞的筛选已经进行了一次间接的鉴定，但是因为选择的遗漏和融合体一方的遗传物质有可能消失，因此有必要对所获得的体细胞杂种植株进行鉴定。鉴定的方法有形态学鉴定、细胞学（染色体）鉴定、同工酶鉴定和分子标记鉴定等，必须视情况选用几种方法配合进行鉴定。

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第五节 植物基因工程改造

植物基因工程（plant genetic engineering）是20世纪80年代兴起和发展起来的技术，它是将目的基因（或DNA片段）分离提取出来，在体外进行酶切和连接，组成重组DNA（recom-binant DNA）并转化到受体细胞（大肠杆菌），使目的基因在受体细胞中复制增殖，然后借助于农杆菌或理化的方法将外源基因导入到植物细胞，经培养、鉴定获得可表达目的基因的再生植株。目的基因是符合种质资源改造目标的、可从所有的生物中获取的基因或DNA片段，它可以通过一定的方法将其分离出来，将其克隆到载体后可以大量增殖。将外源基因导入到植物受体除了要有目的基因以外，还必须要有载体系统、标记基因（或报告基因）与合适的选择条件，使植物细胞有效再生成株的组织培养系统，以及外源基因导入到受体植物的途径和方法。

对于植物基因工程技术，本课程只介绍利用其改造种质资源的内容，因此，对于如何分离和克隆目的基因，如何利用和构建基因工程载体等内容，此处不作介绍，只重点讲解外源基因导入到植物受体的方法、转化植物细胞的筛选和转基因植株的检测。

一、目的基因的导入

由于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）Ti质粒的基因转移功能的发现，使得基因工程技术获得了飞速发展，目的基因导入的方法也越来越多。这些方法主要分为农杆菌等为载体介导的载体法（vector method）和以物理和化学方法直接导入的物化法（physicochemical method）两大类。每一种方法都有各自的优缺点，在进行转基因工作时，应根据具体情况选择应用。

1．载体法

载体法是运用根癌农杆菌Ti质粒或发根农杆菌（A. rhizogenes）Ri质粒、病毒、脂质体等作为载体将外源基因导入植物细胞的方法。

根癌农杆菌 - Ti质粒法是一个较为完善的植物转化系统，广泛地应用于双子叶植物的转基因研究，但是，对一些单子叶植物难以转化。用农杆菌转化植物组织有单感染法、叶盘法等。单感染法是将含有外源基因的农杆菌直接涂在植株伤口上，经过一段时间后，将该组织切下培养，检测其再生植株的转化率。这种方法简单易行，但物种间转化效果差别较大。叶盘法是将含有外源基因的农杆菌感染从灭菌叶片取出的小叶盘片，再用抗生素进行选择，使带有插入基因的细胞组织再生成植株。该方法简单有效，应用很广。对其加以改进就有利用不同组织的方法，如子叶、茎段、下胚轴、韧皮组织、块茎薄皮组织、细胞或细胞团、原生质体等。以原生质体为受体的农杆菌介导是在原生质体培养的早期（2 ~ 4 d后）进行。

病毒载体（viral vector）法是利用病毒作为载体感染植物，进行基因导入的方法。例如用花椰菜花叶病毒（CaMV）为载体，将卡那霉素抗性基因转移到了芜菁细胞，将抗马铃薯X病毒的基因转移到马铃薯等。

脂质体法是用一种人造类脂或胆固醇与磷脂构成的小体即脂质体（liposomes），作为载体与植物细胞融合而将外源DNA导入的方法。

2．物化法

物化法又称直接导入法。它不需要借助载体，而是通过物理、化学手段将外源基因直接导入植物细胞的方法，包括微弹轰击（microprojectile bombardment）法、电击（electroporation）法、激光微束（laser microbeam）法、PEG（聚乙二醇）法、微注射（microinjection）法、超声波处理（sonication）法、花粉管通道（pollen tube pathway）法等。这些方法比起农杆菌载体法来，虽然转化率低，但是它们具有操作简单、宿主限制小等优点。有的将物化法与载体法结合起来应用，例如超声波辅助的农杆菌介导的转化（sonication-assisted Agrobacterium mediated transformation, SAAT）获得了比单一使用农杆菌介导的更高的转化率。

 　　微弹轰击法又称基因枪（gene gun）或粒子枪（particle gun）法。它是将DNA附着在微小的（1~3μm）金属（钨或金等）颗粒表面，然后高速射入植物细胞，使吸附的DNA整合到染色体上。在许多园艺作物上都有报道。

电击法又称电融合法。它是在强电场作用下，使生物组织细胞发生可逆的透性变化，产生约直径为30 nm的瞬时孔洞，促进DNA分子进入原生质体，从而实现目的基因的导入。电击法使用的电压梯度和脉冲持续时间与原生质体的大小有关。电击法也可与PEG法等结合起来，提高转化频率。

激光微束法是利用一定波长的激光聚焦到达细胞膜表面，引起膜的可逆性穿孔，从而将外源DNA导入植物细胞的方法。

PEG法是利用能促进原生质体直接吸收质粒的聚乙二醇诱导带有DNA的嵌合质粒与原生质体融合而进行基因转化的方法。许多单子叶植物的基因导入采用此法。其缺点是会影响部分植物原生质体的再生能力。

微注射法是在显微镜下由玻璃毛细管（直径0.5 ~ 10 µm）直接将外源DNA分子注射到受体细胞的细胞质或细胞核内。该方法引入外源DNA比其他方法更为直接，既可用于对原生质体的转化，也可对正常细胞、未熟花粉、胚性悬浮细胞、分离的子房、花器分生组织等进行转化。但是，该法要求操作者有较高的技术和经验。

二、转化植物细胞的筛选和转基因植株的检测

植物细胞经载体法间接或物化法直接转化后，大部分细胞是没有转化的，这就需要将这些未转化细胞与极少数转化细胞区别开来，淘汰未转化细胞，然后利用植物细胞的全能性在适宜的环境条件下，使转化细胞再生成可育的转基因植株。这一过程通常采用筛选标记基因（screenable marker gene），如抗菌素抗性基因、抗除草剂基因等来进行。当受体细胞本身不含此类基因时，导入含有或构建有此类基因的供体后，只要其在受体中转化成功，便可用抗菌素或除草剂等进行筛选。由于含除草剂的基因工程植物对人畜无毒害等副作用，是人们喜爱选用的筛选标记。

此外，外源基因是否导入成功，还必须对所获得的转基因植株进行检测才能确定。检测的方法很多，但目的不外乎是检测外源基因是否整合到植物基因组中，是否转录和翻译出蛋白产物，以及转译的水平。

1．外源基因整合到植物基因组的检测

Southern杂交、多聚酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）、报告基因（reporter gene）检测等都是检测外源基因整合到植物基因组中的有效方法。Southern杂交是DNA－DNA杂交，它是将凝胶分离的DNA通过毛细管作用将其转移到硝酸纤维膜上，保持其相对位置不变，然后根据碱基互补原理把固定的DNA与标记（如同位素、生物素等）过的探针杂交，从而检测酸中是否存在特定DNA序列。它不仅可以验证外源DNA是否整合，还可初步估计插入的拷贝数。PCR检测则是针对外源基因的序列，设计一对或多对特异引物，对提取的待检测DNA的进行PCR扩增，进而通过凝胶电泳分离检测其特异条带的有无，来证明外源基因是否整合进入受体植株的基因组。报告基因通常是编码一个在离体条件下易于检测的酶，或者最好是可以在活体条件下进行组织化学定位，这样就可以提供定量的和定性的信息，显示外源基因是否导入。常用的报告基因有 Nos、Ocs、Luc（luciferase，萤光素酶）和GUS（β-glucuronidase，β-葡糖醛酸糖苷酶）基因等。

2．外源基因在植物基因组中转录的检测

Northern杂交是DNA-RNA杂交，它是检测特定组织或器官中外源基因是否转录出mRNA 一种有用的方法。其原理与Southern杂交是一致的。

3．外源基因在植物基因组中翻译的检测

Western杂交则是蛋白质间的杂交，它是检测特定组织或器官中外源基因是否有翻译出特定蛋白质的方法。其方法是将聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离抗原（antigen）固定并转到固体支持物（如硝酸纤维膜或NC膜等）上，然后放在牛血清蛋白或奶粉溶液中温育，以封闭未结合位点，再用特定抗体杂交，抗原 - 抗体结合，经染色后，即可观察分析外源基因表达产生的蛋白质情况。此外，通过对报告基因的酶活性分析，也可检测其表达状况。

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